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肝素钠液相色谱检测专题
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肝素钠（Heparin Sodium）是一种粘多糖硫酸酯类抗凝血药，是目前世界上临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗。此外，由肝素原料药作为原料进一步加工成的低分子肝素（LMWH）也是一类非常重要的抗血栓药物。肝素钠相关药物药典液相检测项目主要包括有关物质的检查和LMWH分子量分布的检测，下面将介绍赛分科技在肝素类药物液相色谱检测上的最新进展。
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一、肝素钠及其制剂有关物质的检查
2008年美国发生“肝素钠事件”，多硫酸软骨素的非法添加被认为是导致事件发生的罪魁祸首，此后，各国药监部门陆续将肝素钠有关物质的检查纳入肝素钠相关药品的检测项目。
1. 肝素钠【有关物质】的检测（2010版中国药典方法、USP方法）
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| 色谱柱: |
Glycomix SAX (4.6x250mm) |
保护柱: |
Glycomix SAX(4.6×50mm) |
| 流动相: |
A:0.04%NaH2PO4, pH 3.0；
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B:0.04%NaH2PO4 +14%NaClO4, pH 3.0 |
| 梯度: |
0min 20%B，60min 90%B，61min 20%B，75min 20%B |
| 流速: |
0.22 mL/min |
检测器: |
UV 202 nm |
| 柱温: |
25 ℃ |
进样量: |
10 μL |
| 样品: |
20 mg/mL肝素钠， 0.2 mg/mL硫酸皮肤素(DS)和0.2 mg/mL多硫酸软骨素 (OSCS) |
| 说明：赛分科技所开发的PS/DVB基质阴离子交换色谱柱——Glycomix SAX对于肝素钠及其杂质（硫酸皮肤素、多硫酸软骨素）有着优异的分离效果。上图中，硫酸皮肤素（DS）和肝素钠之间的分离度为3.8，肝素钠和多硫酸软骨素（OSCS）之间的分离度为5.8，完全满足中国药典和USP“硫酸皮肤素峰和肝素钠峰的分离度应大于1.0，肝素钠峰和多硫酸软骨素峰的分离度应大于1.5”的要求。 |
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2. 肝素钠注射液【有关物质】的检测（2010版中国药典方法）
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| 色谱条件同上。样品:1mL肝素钠注射液，加入0.5mL水混匀。 |
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| 说明：肝素钠注射液有关物质的检测同“肝素钠”，Glycomix SAX对于肝素钠及其杂质依然高效分离。 与肝素钠相比，肝素钠注射液中添加的辅料——苯酚在70分钟出峰。 |
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二、低分子量肝素钠（LMWH）分子量分布的检测
低分子量肝素钠(LMWH)的生物活性与其分子量分布密切相关，随着分子量的降低，其抗FⅡa活性下降，因此LMWH的分子量分布是其质量控制的关键指标。水溶性体积排阻色谱柱——Zenix、SRT等系列SEC柱非常适合水溶性聚合物分子量分布的检测，可对低分子量肝素钠（包括达肝素钠、依诺肝素钠等）的分子量分布进行高效检测。
1. 达肝素钠（卫生部标准（WS-196(X-169)-97)、EP、BP方法)
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| Column: |
Zenix SEC-100, 7.8 x 300 mm |
| Mobile phase: |
2.84% Na2SO4, pH 5.0 with H2SO4 |
| Flow rate: |
0.5 mL/min |
| Detector: |
UV 234 nm and RI |
| Column temperature: |
35℃ |
| Injection volume: |
25 μL |
| Sample: |
10mg/mL Dalteparin Sodium |
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说明：卫生部标准（WS-196(X-169)-97）、欧洲药典（EP）和英国药典（BP）对于低分子量肝素钠的检测方法相同。均要求LMWH重均分子量在8000以下，小于8000的级分不少于60%。此外，EP、BP要求达肝素钠，相对分子质量应介于5600-6400，分子量小于3000的组分所占比例应不高于13%，分子量大于8000的组分所占比例在15-25%。
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| 2. 依诺肝素钠（卫生部标准（WS-196(X-169)-97)、EP、BP方法) |
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| Column: |
Zenix SEC-100, 7.8 x 300 mm |
| Mobile phase: |
2.84% Na2SO4, pH 5.0 with H2SO4 |
| Flow rate: |
0.5 mL/min |
| Detector: |
UV 234 nm and RI |
| Column temperature: |
35℃ |
| Injection volume: |
25 μL |
| Sample: |
10mg/mL Enoxaparin Sodium |
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说明：EP要求，依诺肝素钠相对分子质量应介于3800-5000，特征分子量4500。
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| 3. 依诺肝素钠（USP方法) |
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| Column: |
Zenix-300 (7.8 x 300 mm) + Zenix-150 ( 7.8 x 300 mm) |
| Guard column: |
Zenix-300(7.8 x 50 mm) |
| Mobile phase: |
0.5 M LiNO3 |
| Flow rate: |
0.6 mL/min |
| Detector: |
RI |
| Column temperature: |
25℃ |
| Injection volume: |
20 μL |
| Sample: |
10mg/mL Enoxaparin Sodium |
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