概述

   ProAqa Excel亲和色谱柱专门适用于细胞系筛选或上游生物工艺优化和质量控制过程中快速准确的单克隆抗体定量。填料是由平均粒径20 µm、孔径1000-2000 Å的均一的PS/DVB填料颗粒与重组蛋白A配体偶联而成，该配体能与除IgG3以外的免疫球蛋白以及含Fc的融合蛋白结合。填料具有机械强度，可以承受高流速和高压操作。

技术参数

 填料特性

空白对照

要使用高纯度的缓冲液，缓冲液使用前需要排气和过滤（0.22 μm）。进样前，请务必做空白对照，并仔细检查峰积分结果中是否存在噪音或基线绘制不正确。为了降低结合缓冲液和洗脱缓冲液转变时引起的基线波动，建议使用：
（a）50 mM磷酸盐（pH 7.0），0.15 M NaCl作为起始/冲洗溶液。
（b）100 mM磷酸钠，0.15 M NaCl（pH 2.5）或100 mM甘氨酸，0.15 M NaCl（pH 2.5）作为洗脱缓冲液。
这些是对信号噪音最小化最有效的洗涤/洗脱液。盐酸（HCl）能使抗体变性，所以洗脱产品如果需要生物活性的话，不建议添加HCl。

起始/冲洗溶液

（a）大多数情况下，可以使用简单的缓冲液，例如10-100 mM的磷酸盐或Tris。
（b）结合/洗脱缓冲液的pH范围为6.0-7.5，但是请注意，在较高的pH范围下结合力最强。
（c）添加一些盐（0.1-0.2 M NaCl或KCl）抑制蛋白间相互作用的非特异性吸附。

洗脱条件

对于分析应用，使用25-100 mM磷酸盐（pH 2.0-3.5），含或不含高达150 mM的NaCl。可以使用的其他洗脱缓冲液成分包括磷酸钠、盐酸、甘氨酸、柠檬酸盐、醋酸盐以及其他含低pH成分的缓冲液。
由于抗体的结合/洗脱行为因种类和亚类而异，因此应凭经验确定最佳洗脱条件。

样品准备和上样

为了保证高效结合和避免柱子滤片堵塞，样品一般按以下方式准备：
（a）溶解或交换样品到起始/洗涤缓冲液，这对于大份样品（大于25%柱体积）尤其重要。
（b）进样前离心或用0.22 μm滤膜过滤样品。
（c）热处理血清样品（56℃加热30 min）去除残留的纤维蛋白原，它们会在多次运行中阻塞色谱柱。
（d）尽可能对样品脱脂，因为脂质会引起不可逆的结垢。

为保证高效结合及避免填料和色谱柱污染，需要确认上样量：
（a） 图2和图3显示了ProAqa Excel色谱柱的动态测试范围。
（b） 其他抗体的结合能力取决于抗体来源和亚类。
（c） 需要优化结合和洗脱条件并用样品确认，以确保达到最够的结合平衡和完全洗脱。
（d） 在分析应用中，最小和最大载量应该通过标准曲线的线性确定（如图2所示，对于样品浓度在0.029-7.500 mg/mL的常用定量分析，可以将检测波长设置为280 nm。如图3所示，如果样品浓度较高（高达40 mg/mL），波长可设置为300 nm。在该分析应用中，建议使用双波长检测（280 nm和300 nm）。

 ProAqa Excel亲和色谱柱使用手册（中文、English）